La purificación, indentificación y caracterización de una fosfodiesterasa-1A asociada a membranas plasmáticas del músculo liso traqueal de bovino

Ensayo Clínico

Tesis de grado (Doctor en Ciencias Fisiológicas) -- Universidad Central de Venezuela. Facultad de Medicina. Coordinación de Estudios de Postgrado, feb. 2014.

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La activación de receptores muscarínicos aumenta los niveles de AMPc/GMPc en el músculo liso traqueal de bovino mediante la inhibición de fosfodiesterasas, efecto similar fue producido por el isobutilmetilxantina (inhibidor no selectivo de PDEs) y la vinpocetina (inhibidor específico de PDE-1). El objetivo fue purificar y caracterizar a una PDE-1 dependiente de calcio y calmodulina (Ca2+CaM) e inhibida por vinpocetina, presente en las fracciones de membranas plasmáticas del MLTB, la PDE fue extraída de la membrana utilizando un amortiguador de baja fuerza iónica y luego purificada 38 veces utilizando dos columnas, (Q-sefarosa y CaM-agarosa), que fue inhibida por vinpocetina y estimulada por CaM, observándose mediante electroforesis dos bandas (56, 58 KDa) siendo identificada una PDE1A (58 KDa) por “Western blotting”. La PDE fue cuantificada utilizando [3H]GMPc y [3H]AMPc cuyos parámetros cinéticos fueron: Km (æM) para AMPc (8,4 ñ 0.67) y GMPc (6,1 ñ 1,49); Vmax (pmol/min./mg. de proteínas) para AMPc (99 ñ 3) y GMPc (66 Ý 5). La vinpocetina mostró IC50 (æM) para AMPc (4,9 ñ 0,20) y GMPc (4,6 ñ 0,30). La CaM estimuló dos veces la PDE-1A con un K(A) (nM) para AMPc (2,0 ñ 0,5) y GMPc (1,6 ñ 0,3); Vmax para AMPc (130 ñ 12) y GMPc (110 ñ Ý10). El Mg2+ mostró un K(A) (mM) para AMPc (0,3 ñ 0,02) y GMPc (0,2 ñ 0,01); Vmax para AMPc (99 Ý 3) y el GMPc (72 ñ 5). Se logró la purificación, identificación y caracterización de una PDE-1A sensible a vinpocetina y estimulada por Ca2+CaM en el MLTB(AU)

Aprobado